Archiwum projektów
Zakończone projekty badawcze realizowane w Zakładzie Immunologii WUM
Strategia rozwoju badań naukowych w dziedzinie immunoonkologii - iONKO (2019-2022) - kierownik Jakub Gołąb
Projekt finansowany w ramach programu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego „Regionalna Inicjatywa Doskonałości”. Nr umowy: 013/RID/2018/19
Celem projektu iONKO jest podniesienie poziomu badań podstawowych oraz aplikacyjnych prowadzonych w Warszawskim Uniwersytecie Medycznym (WUM), w jednej z najszybciej rozwijających się dziedzin medycyny, którą jest immunoonkologia. Badania podstawowe w dziedzinie immunoonkologii doprowadzą do lepszego zrozumienia interakcji pomiędzy nowotworem i układem odpornościowym oraz do identyfikacji nowych celów terapeutycznych. Dzięki poszerzonej współpracy z sektorem biotechnologicznym i farmaceutycznym, badania prowadzone w WUM przyczynią się do powstania nowych leków, a więc będą miały bezpośrednie zastosowanie w gospodarce.
Dzięki znacznym nakładom finansowym pochodzącym z własnych środków (koszty pośrednie projektów BASTION i STREAM oraz dotacja finansowa Rektora WUM), udało nam się zorganizować bardzo nowoczesne laboratorium badawcze. Wykorzystując tę nowoczesną infrastrukturę mamy możliwość włączenia się w najbardziej aktualne wątki badawcze, których nie byliśmy dotychczas w stanie realizować w standardowych warunkach hodowli, czy też w układach doświadczalnych opartych o pracę in vitro. Odpowiednią wiedzę i modele doświadczalne udało nam się uzyskać dzięki intensywnym międzynarodowym wymianom naukowym realizowanym w ramach projektów BASTION i STREAM (w sumie ponad 3 lata szkoleń w najlepszych europejskich ośrodkach badawczych). W ramach programu iONKO planujemy rozwinąć wiele modeli badawczych, jednocześnie starając się pracować nad nowymi strategiami terapeutycznymi. Ponadto będziemy badać mechanizmy immunoregulacyjne, wpływające na rozwój przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej. Badania naukowe prowadzone w ramach programu dotyczyć będą czterech obszarów związanych z immunoonkologią, które są opisane poniżej:
- Badanie wpływu metabolizmu aminokwasów w środowisku nowotworowym na rozwój odpowiedzi immunologicznej
- Rozwój terapii adoptywnej z zastosowaniem receptorów CAR
- Badanie właściwości immunoregulatorowych komórek pochodzenia szpikowego
- Opracowanie nowych immunoterapii nasilających przeciwnowotworowe działanie terapii fotodynamicznej
1. Badanie wpływu metabolizmu aminokwasów w środowisku nowotworowym na rozwój odpowiedzi immunologicznej
Rozwój nowotworu zależy nie tylko od potencjału proliferacyjnego samych komórek nowotworowych, lecz również od aktywności licznych populacji komórek mikrośrodowiska guza. Do komórek mikrośrodowiska należą, między innymi, komórki zrębu, w tym naczyń krwionośnych, limfatycznych, czy naciekające guz komórki układu odpornościowego. W rozwijającym się guzie między tworzącymi go komórkami mikrośrodowiska a komórkami nowotworowymi dochodzi do wytworzenia złożonych sieci wzajemnych powiązań i zależności, w tym kompetycji o związki niezbędne do prawidłowego przebiegu przemian metabolicznych. Do aminokwasów, których dostępność jest szczególnie ważna w progresji nowotworu, należą L-arginina, L-tryptofan, L-fenyloalanina oraz L-glutamina. L-arginina ulega przemianom w tak zwanym cyklu mocznikowym: jest rozkładana przez enzym zwany arginazą do L-ornityny i mocznika, aby następnie, w przebiegu trzech następujących po sobie reakcji tego cyklu została zsyntetyzowana z L-argininobursztynianu. Ekspresja enzymów cyklu mocznikowego nie jest ograniczona wyłącznie, jak kiedyś sądzono, do hepatocytów. Wiadomo, że arginaza-1 jest wytwarzana nie tylko, w niewielkim stopniu, przez same komórki nowotworowe, ale również, i to w przeważającej ilości, przez komórki układu odpornościowego naciekające guz, uczestniczące w tworzeniu immunosupresyjnego mikrośrodowiska nowotworu (komórki supresorowe pochodzenia szpikowego czy makrofagi populacji M2). Opublikowane do tej pory dane wskazują na to, że brak L-argininy hamuje proliferację oraz ogranicza funkcje efektorowe limfocytów T, głównie poprzez zmniejszenie ilości w błonie komórkowej tych komórek łańcucha zeta cząsteczki CD3, kluczowej składowej kompleksu receptorowego limfocytów T (TCR). Co ważne, badania, na podstawie których wyciągnięto powyższe wnioski były wykonywane w hodowlach limfocytów in vitro. Niewiele wiadomo, czy i jak modyfikacja dostępności L-argininy w mikrośrodowisku guza, czy to poprzez zahamowanie aktywności enzymatycznej arginazy-1 czy też zahamowanie ekspresji tego enzymu, wpływa na rozwój przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej.
2. Rozwój terapii adoptywnej z zastosowaniem receptorów CAR
Jednym z największych przełomów ostatnich lat w dziedzinie immunoterapii jest zastosowanie technologii chimerycznych receptorów antygenowych (CAR, ang. chimeric antygen receptors). Receptory CAR umożliwiają ukierunkowanie ataku komórek efektorowych układu odpornościowego, takich jak limfocyty T lub komórki NK, na praktycznie dowolną cząsteczkę występującą na powierzchni komórki nowotworowej. Wiele obecnych badań koncentruje się na udoskonalaniu terapii CAR. Niniejszy projekt wpisuje się w te najnowsze trendy mając na celu stworzenie w Polsce unikatowego na skalę krajową ośrodka prowadzącego badania nad terapiami adoptywnymi z zastosowaniem CAR. W ramach projektu iONKO planujemy stworzyć platformę umożliwiającą efektywną modyfikację komórek efektorowych z zastosowaniem wybranych receptorów CAR. Znaczna część procesów optymalizacji będzie dotyczyła także testowania wybranych domen aktywujących oraz regionów zawiasowych, które są nieodzownym elementem składowym CAR wpływającym na proces aktywacji, jak i utrzymywania się w krążeniu chorych modyfikowanych komórek. Ważnym zadaniem będzie także analiza bioinformatyczna dostępnych sekwencji przeciwciał rozpoznających pożądane antygeny. Bazując na tych sekwencjach zostaną zaprojektowane sekwencje scFv, które są niezbędnym elementem struktury CAR odpowiedzialnym za selektywne wiązanie wybranych antygenów. Jak dotąd najbardziej spektakularne sukcesy immunoterapii uzyskano z udziałem limfocytów CAR rozpoznających cząsteczkę CD19. Mniej optymistyczne są wyniki badań wykorzystania receptorów CAR w leczeniu guzów litych, co związane jest z małą ilością unikatowych antygenów charakterystycznych dla tych nowotworów i wynikającą z tego niespecyficznością działania receptorów CAR oraz z niekorzystnym wpływem mikrośrodowiska nowotworu, które hamuje aktywność limfocytów cytotoksycznych oraz komórek NK. Mamy nadzieję, że stworzona przez nas platforma, poprzez dostarczenie podstawowych informacji na temat mechanizmów aktywowania komórek modyfikowanych CAR oraz czynników mikrośrodowiska hamujących ich działanie przeciwnowotworowe umożliwi rozwijanie nowych adoptywnych terapii przeciwnowotworowych.
3. Badanie właściwości immunoregulatorowych komórek pochodzenia szpikowego
Wzrost guzów nowotworowych jest aktywnie wspierany przez komórki odpornościowe pochodzenia szpikowego, między innymi przez monocyty czy makrofagi oraz ich niedojrzałe prekursory (określane jako immunoregulatorowe komórki pochodzenia szpikowego, MDSC). Rozwijający się nowotwór potrzebuje: (i) dostarczenia czynników wzrostowych i odżywczych, (ii) zahamowania odpowiedzi immunologicznej, (iii) zapewnienia wzrostu nowych naczyń krwionośnych. We wszystkie powyższe procesy zaangażowane są aktywnie komórki pochodzenia szpikowego. Zmiana aktywności tych komórek może prowadzić do zaniku ich pronowotworowych efektów. We wcześniejszych badaniach wykazaliśmy, że stymulacja szlaków sygnałowych (TLR7 i CD200R) powoduje zmianę stanu ich zróżnicowania i aktywności. Ponadto zaobserwowaliśmy, że stymulacja makrofagów pochodzenia szpikowego hemoglobiną (Hb), powoduje długotrwałe zwiększenie ekspresji białka Ly6C. Jest to marker niezróżnicowanych monocytów, który ulega zanikowi w makrofagach. Co istotne, stymulacja Hb (białkiem bogatym w żelazo), powoduje bardziej długotrwały efekt niż klasyczny czynnik prozapalny (LPS). Ponadto, z danych literaturowych wiadomo, że hemoglobina zmienia stan aktywacji makrofagów. Planujemy zbadać efektywność terapeutyczną manipulacji szlakami regulującymi aktywnością komórek pochodzenia szpikowego, celując w receptory TLR, receptory hamujące PD-1, CTLA-4, CD200R) w kombinacji z podawaniem nośników żelaza (np. usieciowanym tlenkiem żelaza, Hb, ferrytyną). Kombinacje terapeutyczne będą testowane w mysich modelach guzów litych i w hodowlach komórkowych ex vivo. Zbadamy efekt ww. kombinacji terapeutycznych na stan aktywacji i zróżnicowania komórek pochodzenia szpikowego m.in. za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto, zbadamy wpływ najbardziej efektywnych terapii na profil ekspresji genów w wyselekcjonowanych populacjach komórek szpikowych m.in. za pomocą RNAseq lub profilowania proteomu. Rolę komórek pochodzenia szpikowego w immunoregulacji zbadamy również w nowotworze układu krwiotwórczego - przewlekłej białaczce limfocytowej (PBL). Jest to jeden z najczęstszych rozrostów hematologicznych występujących u osób dorosłych. PBL to choroba przewlekła o zróżnicowanym przebiegu, która u wielu chorych przybiera postać agresywną, oporną na leczenie. Żaden z dostępnych na rynku leków drobnocząsteczkowych nie prowadzi do trwałych wyleczeń PBL. Jedyną metodą leczenia chorych, u których rozwinęła się oporność na leczenie, jest immunoterapia. Niestety, skuteczność immunoterapii w PBL jest dość mocno ograniczona. Trwałą odpowiedź na leczenie za pomocą limfocytów T zmodyfikowanych cząsteczkami CAR anty-CD19 (CTL019) obserwuje się jedynie u 20-30% chorych. Zastosowanie inhibitorów punktów kontrolnych układu odpornościowego u chorych na PBL daje jeszcze mniej zadowalające efekty. Przypuszcza się, że główną przyczyną ograniczonej skuteczności immunoterapii w PBL jest immunosupresja. U chorych na PBL zaobserwowano dysfunkcję limfocytów T: zmniejszenie odsetka limfocytów dziewiczych, zwiększenie odsetka limfocytów pamięci i limfocytów regulatorowych, a także wzrost ekspresji markerów „wyczerpania” (PD1, LAG3) na limfocytach T. W ramach projektu iONKO planujemy zbadać mechanizmy odpowiedzialne za immunosupresję obserwowaną w PBL, w szczególności mechanizmy związane z aktywnością mieloidalnych komórek szpikowych.
4. Opracowanie nowych immunoterapii nasilających przeciwnowotworowe działanie terapii fotodynamicznej
Terapia fotodynamiczna jest bardzo skuteczną metodą leczenia nowotworów, mającą coraz więcej wskazań klinicznych. Składa się ona z trzech elementów: związku fotouczulającego, światła laserowego i tlenu, spośród których żaden nie jest toksyczny dla komórek nowotworowych, ale w połączeniu prowadzą do ich zniszczenia. W pierwszym etapie choremu podawany jest związek fotouczulający (fotouczulacz). Związek ten gromadzi się we wszystkich komórkach organizmu, z pewną, zależną od rodzaju fotouczulacza, selektywnością wobec komórek nowotworowych. Następnie nowotwór naświetlany jest światłem laserowym o takiej długości fali, która zdolna jest do wzbudzenia fotouczulacza. W obecności tlenu dochodzi do zainicjowania w naświetlonych komórkach złożonych reakcji fotochemicznych prowadzących do wytworzenia rodników i reaktywnych form tlenu, które uszkadzają struktury wewnątrzkomórkowe. Terapia fotodynamiczna charakteryzuje się podwójną selektywnością. Po pierwsze wiele leków fotouczulających gromadzi się w większym stężeniu w komórkach nowotworowych niż w prawidłowych, a po drugie światłem laserowym naświetlany jest jedynie nowotwór z niewielkim marginesem zdrowej tkanki. Przy użyciu cienkich światłowodów, można poddać terapii fotodynamicznej nawet niedostępne z zewnątrz nowotwory. Terapia ta okazuje się skuteczna w leczeniu raków oskrzela, przewodu pokarmowego, dróg żółciowych, raków znajdujących się w jamie otrzewnej, raków szyjki macicy a nawet guzów ośrodkowego układu nerwowego. Ogromną zaletą tej terapii jest jej nieinwazyjność. Większość zabiegów można wykonywać ambulatoryjnie, a pacjent może nawet w dniu zabiegu wrócić do domu. Największym ograniczeniem terapii fotodynamicznej jest jej lokalne działanie, ograniczone do naświetlanego obszaru guza. Z tego powodu jest to głównie terapia paliatywna, która z coraz większym powodzeniem zastępuje paliatywne leczenie chirurgiczne (zabieg ambulatoryjny, niewiele powikłań, zachowanie prawidłowej anatomii naświetlanych narządów). Badania prowadzone od wielu lat przez nasz zespół jednoznacznie wykazały, że PDT indukuje bardzo silną, lokalną reakcję zapalną, która wiąże się z uwolnieniem z martwych (nekrotycznych) komórek nowotworowych szeregu alarmin (zwanych również cząsteczkami DAMP) oraz antygenów pochodzących z komórek nowotworowych. Niestety mimo silnej lokalnej aktywacji komórek układu odpornościowego nie dochodzi zazwyczaj do rozwoju swoistej odpowiedzi immunologicznej, która mogłaby się przyczynić do zahamowania wzrostu odległych przerzutów. Wykazaliśmy między innymi, iż wiąże się to z indukcją szeregu mechanizmów adaptacyjnych w obrębie guza, związanych z nasilonym metabolizmem aminokwasów, uszkodzeniem naczyń limfatycznych i pobudzeniem komórek pochodzenia szpikowego do wydzielania cytokin i czynników wzrostu hamujących aktywność limfocytów. Jako pierwsi w świecie wykazaliśmy nasilone działanie przeciwnowotworowe terapii fotodynamicznej stosowanej w kombinacji z inhibitorami punktu kontrolnego (check-point inhibitors). W ramach prowadzonych badań planujemy bezpośrednio wykorzystać wyniki opisanych powyżej obszarów badawczych aby zwiększyć skuteczność terapii fotodynamicznej.
Dzięki powyższej koncepcji badawczej, realizowany projekt umożliwi skoncentrowanie wszystkich naszych wysiłków na stworzeniu ośrodka z międzynarodową renomą specjalizującego się w badaniach dotyczących immunoonkologii. Naszym celem jest stworzenie zespołu, który nie tylko jest rozpoznawany i zapraszany do współpracy przez najlepsze międzynarodowe ośrodki naukowe, ale także stanie się jednostką inicjującą badania międzynarodowych konsorcjów badawczych. Stworzenie mocnego zespołu składającego się z najlepszych naukowców prowadzących badania to podstawowy element, niezbędny do realizacji projektu. Zbudowanie zespołu z odpowiednią bazą wiedzy i potencjałem intelektualnym wymaga czasu, wysiłku i właściwych inwestycji. W trakcie realizacji poprzednich projektów, stworzyliśmy ogromny potencjał naukowy zatrudniając najlepszych naukowców, którzy współpracują ze sobą uzupełniając się wiedzą i umiejętnościami. Kolejnym niezbędnym warunkiem prowadzenia badań naukowych na wysokim poziomie jest zapewnienie wystarczających środków finansowych. Realizując niniejszy projekt planujemy wystąpić o dodatkowe środki finansowe przyznawane w trybie konkursowym na realizację projektów obejmujących badania naukowe przez instytucje krajowe, zagraniczne lub organizacje międzynarodowe. Osiągniecie tego celu będzie możliwe dzięki wynikom wstępnym wygenerowanym dzięki projektowi iONKO.
OPUS13 – kierownik: Jakub Gołąb
Zbadanie roli arginazy-1 jako potencjalnego celu terapii w leczeniu szpiczaka oraz w zmniejszaniu kardiotoksycznego działania inhibitorów proteasomu
Szpiczak plazmocytowy jest nowotworem wywodzącym się z terminalnie zróżnicowanych limfocytów B. Choroba wykrywana jest zazwyczaj u ludzi w podeszłym wieku i prowadzi do rozwoju wielu powikłań narządowych (niewydolność nerek, niedokrwistość, patologiczne złamania kości) i upośledzenia odporności. Mimo pojawienia się nowych, coraz bardziej skutecznych terapii szpiczak pozostaje nadal nieuleczalny u większości chorych, a średnie przeżycie wynosi nie więcej niż 6 lat. Wiele nowoczesnych terapii nowotworów wiąże się z wystąpieniem działań niepożądanych w obrębie układu krążenia. Powikłania sercowe leków przeciwnowotworowych są drugą co do częstości przyczyną długotrwałych problemów zdrowotnych. Z tego powodu wydaje się, że niezwykle cenne jest poszukiwanie takich kombinacji terapeutycznych, w których leki nie tylko nasilałyby swoje przeciwnowotworowe działanie, ale jednocześnie specyficznie zmniejszałyby działania niepożądane. W naszych poprzednich badaniach wykazaliśmy, że bortezomib, inhibitor proteasomu stosowany w leczeniu szpiczaka jest kardiotoksyczny. Dane literaturowe wskazują na to, że przypuszczalny mechanizm tej kardiotoksyczności może wynikać z zahamowania syntezy tlenku azotu (NO). Potwierdzają to nasze kolejne badania, w których zaobserwowaliśmy, że sildenafil – lek aktywujący w komórkach szlak przekazywania sygnałów związany z działaniem NO, częściowo odwraca kardiotoksyczne działanie bortezomibu. Substratem do wytworzenia NO jest aminokwas L-arginina. Aminokwas ten jest w organizmie metabolizowany również przez inne enzymy, w tym arginazę-1 (Arg-1), która go degraduje. Zaobserwowaliśmy, że inhibitor Arg-1 opracowany przez firmę OncoArendi we współpracy z naszym zespołem zwiększa wytwarzanie NO u myszy. Na podstawie tych danych wysuwamy hipotezę, że inhibitor Arg-1 może zmniejszać kardiotoksyczne działanie bortezomibu. Jednocześnie Arg-1 jest enzymem wytwarzanym przez komórki zrębu wielu typów nowotworów, który bardzo silnie hamuje proliferację limfocytów i rozwój swoistej odpowiedzi przeciwnowotworowej. Dotychczas nie badano jednak dokładnie funkcji tego enzymu w progresji szpiczaka plazmocytowego. Celem zaplanowanych przez nas badań jest zatem sprawdzenie, czy rzeczywiście Arg-1 odgrywa rolę w zahamowaniu skutecznej odpowiedzi immunologicznej a tym samym w progresji szpiczaka. W badaniach wykorzystamy genetycznie modyfikowane szczepy myszy, w tym zwierzęta pozbawione genu dla Arg-1 oraz szczepy myszy transgenicznych, które umożliwią nam badanie swoistej odpowiedzi immunologicznej. Zbadamy czy brak Arg-1 lub farmakologiczne zahamowanie aktywności tego enzymu wpłyną na progresję szpiczaka i rozwój odpowiedzi immunologicznej. Zbadamy również, czy inhibitor Arg-1 może nasilać przeciwnowotworowe działanie bortezomibu oraz czy zmniejszy jego kardiotoksyczność u zwierząt. Wiedza zdobyta dzięki tym badaniom pozwoli lepiej rozumieć molekularne mechanizmy związane z rozwojem szpiczaka, przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej i działań niepożądanych leków stosowanych w onkologii. Mamy nadzieję, że wyniki naszych badań umożliwią również zidentyfikowanie nowych obszarów badawczych, które będzie można wykorzystać w rozwoju immunologii, kardioonkologii i onkologii doświadczalnej.
DIAMENTOWY GRANT – kierownik: Paweł Matryba
Zbadanie wpływu inhibitora arginazy-1 na rozwój antygenowo-swoistej odpowiedzi immunologicznej w węzłach limfatycznych
Immunoterapia nowotworów stała się w ostatnich latach skuteczną metodą leczenia nowotworów, prowadząc do całkowitej remisji choroby w 20-30% przypadków. Niemniej nadal u wielu chorych terapia ta jest nieskuteczna i trwają poszukiwania mechanizmów oporności na immunoterapię. Jednym z takich potencjalnych mechanizmów może być aktywność arginazy, enzymu rozkładającego L-argininę. Zmniejszone stężenie argininy w mikrośrodowisku guza lub w drenujących okolicę nowotworu węzłach limfatycznych hamuje proliferację limfocytów poprzez zmniejszenie ekspresji łańcuchów CD3ζ i CD3ε, będących składnikami kompleksu receptorowego limfocytów T (TCR) służącego do rozpoznawania antygenów. Nasze wstępne badania wskazują na to, że arginaza hamuje proliferację limfocytów T, a inhibitor arginazy, opracowany we współpracy z naszym zespołem, odwraca supresyjny wpływ arginazy na limfocyty w warunkach hodowli komórkowych. Głównym zadaniem naukowym projektu jest zbadanie działania inhibitorów arginazy na rozwój antygenowo-swoistej odpowiedzi immunologicznej limfocytów T w całkowicie nowym modelu badawczym, wykorzystującym przezroczyste narządy limfatyczne. W tym celu opracowana zostanie metoda umożlwiająca otrzymanie przezroczystych węzłów limfatycznych, co umożliwi ich szybkie, mikroskopowe obrazowanie w całości, w naturalnym stanie trójwymiarowym. Wykorzystanie w badaniach antygenowo swoistych limfocytów T izolowanych z podwójnie transgenicznych myszy, w których konstytutywnej ekspresji ulega białko fluorescencyjne DsRed pozwoli na lokalizację i stworzenie mapy dystrybucji przestrzennej wszystkich limfocytów w obrębie całego, nie ciętego na skrawki histologiczne, węzła limfatycznego. Realizacja założeń projektu przyczyni się do opracowania protokołu ‘utransparentniania’ węzłów limfatycznych, który nie powoduje zniszczenia ich struktury mikroskopowej, ani degradacji białek wykazujących fluorescencję. Nowa metoda może w przyszłości pomóc w rozwikłaniu wielu problemów badawczych, obecnie ograniczonych koniecznością obrazowania jedynie wycinków tkanek. Spodziewane jest, iż zastosowanie opisanego, nowatorskiego modelu badawczego da precyzyjny opis immunostymulującego wpływu inhibitora arginazy-1 na odpowiedź komórkową limfocytów T. Wynik ten może stanowić istotny argument uzasadniający podjęcie prób włączenia związków tej klasy do badań klinicznych w połączeniu z immunoterapią nowotworów.
HARMONIA (2015-2020) - kierownik: Tomasz Stokłosa
Zidentyfikowanie nowych, istotnych klinicznie zmian genetycznych i epigenetycznych przy zastosowaniu wysokoprzepustowego sekwencjonowania następnej generacji u chorych na przewlekłą białaczkę szpikową z niekorzystnym przebiegiem choroby
Przewlekła białaczka szpikowa (PBSz) jest modelową choroba nowotworową, badania nad tą chorobą zaowocowały przełomowymi odkryciami i doprowadziły do rozwoju terapii celowanej w onkologii; po raz pierwszy w tej chorobie powiązano zmianę genetyczną z procesem nowotworowym, również po raz pierwszy w tym nowotworze osiągnięto sukces przy zastosowaniu terapii celowanej inhibitorami kinaz tyrozynowych. Niestety, u znaczącej części chorych pojawia się oporność na taką terapię, innym problem to brak całkowitego wyleczenia związany z niewrażliwością na terapię białaczkowych komórek macierzystych. Podstawowym celem projektu jest wykrycie aberracji w genomie i epigenomie PBSz odpowiedzialnych za niekorzystny przebieg choroby, czyli oporność na terapię celowaną i/lub progresję do fazy ostrej, przy zastosowaniu technik wysokoprzepustowego sekwencjonowania NGS (next-generation sequencing). Następnym celem jest zbadanie potencjalnej roli biologicznej odkrytych aberracji i próba eksperymentalnego blokowania w modelach in vitro. W projekcie poszukiwanie nowych aberracji genetycznych i epigenetycznych w PBSz wykonywane jest z użyciem technologii wzbogacania bibliotek DNA w określone sekwencje (eksomowe oraz wyspy CpG) a następnie sekwencjonowania wysokoprzepustowego. Na modelach PBSz in vitro badana jest rola biologiczna wybranych aberracji w progresji choroby i lekooporności (m.in. poprzez wyciszanie genów, kierunkową mutagenezę) oraz próba eksperymentalnego zablokowania wykrytych celów przy zastosowaniu modelowania komputerowego i syntezy aptamerów. Pomimo pwoszechengo stosowania sekwencjonowania wysokoprzepustowego w onkologii, wiele rzadkich nowotworów pozostało wciąż słabo scharakteryzowanych, czego przykładem jest przewlekła białaczka szpikowa, zwłaszcza pod kątem zmian odpowiedzialnych za progresję choroby. Poznanie nowych zmian genetycznych i epigenetycznych w PBSz oraz zbadanie ich znaczenia biologicznego na modelach komórkowych może przyczynić się do lepszego zrozumienia patogenezy PBSz oraz do opracowania nowych, lepszych terapii dla pacjentów, u których choroba ma niekorzystny przebieg, jak również takich terapii, które uderzając w nowotworowe komórki macierzyste dadzą szansę na całkowite wyleczenie. Realizacja grantu HARMONIA umożliwia nie tylko kontynuację ale znaczące rozszerzenie wieloletniej współpracy pomiędzy kierownikiem projektu (dr Tomasz Stokłosa) a partnerem zagranicznym (dr hab. Tomasz Skórski). Zespół wykonawców obejmujący naukowców (genetyków, biotechnologów i bioinformatyków) oraz klinicystów i nowoczesny warsztat do badań genetycznych (platforma NGS) dostępny na WUM z jednej strony, a z drugiej strony możliwości badań translacyjnych na modelach in vitro u partnera zagranicznego włącznie z modelowanie komputerowym i syntezą nowych cząsteczek u partnera zagranicznego oraz jego ogromne doświadczenie i ekspertyza w badaniach nad molekularną patogenezą białaczek dają realną szansę na ważne odkrycia. Badania dają szansę na uzyskanie synergii pomiędzy badaniami prowadzonymi przez obu partnerów i mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia patogenezy PBSz a w przyszłości na lepszą terapię dla chorych. W długim terminie wyniki uzyskane w realizacji grantu mogłyby stanowić wstęp do dalszych badań translacyjnych, na modelach in vivo. Dodatkową korzyść stanowią krótkie staże naukowe w celu realizacji zadań badawczych przez młodych członków zespołu dr Stokłosy (mgr inż. Marcin Machnicki oraz mgr inż. Monika Pępek) u partnera zagranicznego na Temple University School of Medicine w Filadelfii, które przyczyniają się do wymiany doświadczeń i metod badawczych.
OPUS (2016-2020) - kierownik: Tomasz Stokłosa
Zbadanie zaburzenia mechanizmów odpowiedzialnych za stabilność telomerów w przewlekłej białaczce szpikowej - znaczenie roli POT1 i RAP1 w niestabilności genomowej w białaczkowych komórkach macierzystych
Aktywność telomerazy oraz niestabilność genomowa są uznawane jako cechy charakterystyczne nowotworów. Jednak w jaki sposób aktywność kompleksu telomerazowego wpływa na niestabilność genomową w nowotworach nie jest w pełni jasne. Przewlekła białaczka szpikowa (PBSz) jest modelową chorobą nowotworową, w której narastająca niestabilność genomowa podczas progresji choroby jest odpowiedzialna za pojawiającą się oporność na terapię celowaną. Pomimo doniesień na temat zróżnicowanej ekspresji telomerazy w różnych fazach PBSz, związek przyczynowy pomiędzy aktywnością kompleksu telomerazowego a mechanizmami genetycznymi odpowiedzialnymi za progresję choroby są słabo poznane. Telomery jako nukleoproteinowe struktury zlokalizowane na końcach eukariotycznych chromosomów są jednymi z kluczowych elementów odpowiedzialnych za utrzymanie genomowej stabilności. Waga tego odkrycia, w szczególności w odniesieniu do poznania fundamentalnych mechanizmów funkcjonowania organizmów na poziomie komórkowym, jak również związku zaburzeń w obszarze telomerów z chorami nowotworowymi czy procesem starzenia zostało docenione Nagrodą Nobla w roku 2009 z fizjologii i medycyny dla E. Blackburn, C. Greider i J.Szostak za odkrycie "jak chromosomy są chronione przez telomery i enzym telomerazę”. Odkryciemożliwości wydłużenia telomerów na drodze alternatywnego szlaku w oparciu o mechanizmyrekombinacji, czy stwierdzaniu braku ekspresji lub aktywności telomerazy w komórkachnowotworowych wskazuje na znacznie bardziej niż sądzono złożoność mechanizmów kontrolującychkompleks telomerowy. Poznanie tych molekularnych mechanizmów jest zatem istotne nie tylko dlasamego faktu zrozumienia przyczyn masowych uszkodzeń chromosomowych ale także dlawykorzystania zmian zachodzących w obrębie telomerów w celach diagnostycznych czyprognostycznych. Istniejące opracowania jak również własne wstępne wyniki jednoznacznie wskazująna silny związek tego procesu ze zmianami zachodzącymi w obrębie telomerów. Proponowany projekt stawia za cel zbadanie i scharakteryzowanie całego kompleksu telomerazowego w różnych fazach choroby i w różnych populacjach komórek białaczkowych, również w białaczkowych komórkach macierzystych w celu zidentyfikowania potencjalnej roli w oporności na terapię i progresję choroby. Spodziewane wyniki projektu powinny przynieść odpowiedź jak jest rola kompleksu telomerazowego w PBSz i pozwolić na głębsze zrozumienie w jaki sposób kompleks telomerazowy i mechanizmy zapewniające utrzymanie długości telomerów (w tym alternatywne mechanizmy wydłużania telomerów) są zaangażowane w patogenezę PBSz. Oczekujemy, iż w kontekście niestabilności genomowej będącej elementem progresji PBSz, może to w przyszłości przyczynić się do znalezienia nowych celów terapeutycznych w komórkach białaczkowych i stworzenia skutecznej terapii dla zaawansowanych stadiów choroby oraz eradykacji klonu białaczkowego.
Opus (2017-2020) – kierownik: dr Małgorzata Firczuk
Ocena skuteczności nowych, synergistycznych kombinacji leków w terapii nowotworów wywodzących się z limfocytów B
Chłoniaki nieziarnicze i białaczki B-komórkowe są rozrostami nowotworowymi wywodzącymi się z limfocytów B. Limfocyty B są krwinkami białymi należącymi do układu odpornościowego. Ich unikalną cechą jest zdolność do wytwarzania przeciwciał. Jednak zanim zaczną one produkować specyficzne przeciwciała, muszą przejść wieloetapowy proces rozwoju. Prekursory limfocytów B powstają w szpiku kostnym, gdzie dojrzewają, a następnie migrują do obwodowych narządów limfatycznych. Tam limfocyty B rozpoznają antygeny, zasiedlają odpowiednie struktury zwane ośrodkami namnażania, intensywnie proliferują i różnicują się w komórki efektorowe produkujące przeciwciała. Nowotwory wywodzące się z limfocytów B powstają na różnych etapach rozwoju tych komórek. Chłoniaki nieziarnicze i ostra białaczka limfoblastyczna wywodzą się głównie z ośrodków namnażania. U dorosłych są to zdecydowanie najczęstsze nowotwory układu krwiotwórczego. Główną metodą leczenia jest obecnie mało selektywna chemioterapia w połączeniu z terapią przeciwciałami monoklonalnymi. Odpowiedź na tą metodę leczenia jest zwykle dobra, jednak u części pacjentów, aż do 30% w zależności od podtypu, dochodzi do nawrotu choroby, często opornego na leczenie. Poszukiwanie nowych strategii terapeutycznych może przyczynić się do poprawy skuteczności leczenia nowotworów wywodzących się z limfocytów B.
Nowotworowe limfocyty B, ze względu na podwyższony metabolizm i pod wpływem chemioterapii, generują większe ilości reaktywnych form tlenu w porównaniu do komórek prawidłowych, co prowadzi do stresu oksydacyjnego. To z kolei indukuje ekspresję enzymów antyoksydacyjnych, które umożliwiają komórkom nowotworowym przeżycie w warunkach stresu. Co więcej, enzymy te mogą przyczyniać się do oporności na leczenie. W badaniach wstępnych prowadzonych na liniach komórkowych chłoniaka nieziarniczego i przewlekłej białaczki limfoblastycznej B komórkowej zaobserwowaliśmy synergistyczne, cytotoksyczne działanie dwuskładnikowej kombinacji zawierającej inhibitor jednego z enzymów antyoksydacyjnych oraz związek indukujący powstawanie reaktywnych form tlenu. Co ciekawe, kombinacja ta nie jest toksyczna dla prawidłowych limfocytów B.
Głównym celem projektu jest ocena skuteczności i selektywności terapii dwuskładnikowej w leczeniu chłoniaków nieziarniczych oraz ostrej białaczki limfoblastycznej B komórkowej w badaniach przedklinicznych. Ponadto planujemy zbadanie mechanizmu działania tej terapii oraz wpływu na szlaki sygnałowe odgrywające kluczową rolę dla przeżycia nowotworowych limfocytów B. Na uwagę zasługuje fakt, że obydwa składniki badanej terapii są dopuszczone do stosowania u pacjentów od wielu lat, zatem ich farmakokinetyka, dawkowanie i profil bezpieczeństwa są dobrze poznane. Otrzymane przez nas wyniki mogą być przesłanką do podjęcia badań klinicznych i mogą doprowadzić do bardziej skutecznego leczenia nowotworów wywodzących się z limfocytów B.
W projekcie zaplanowaliśmy realizację trzech zadań badawczych. W Zadaniu 1 planujemy ocenić wpływ badanej, dwuskładnikowej terapii na proliferację i przeżycie nowotworowych i prawidłowych limfocytów B. Zostaną użyte następujące modele badawcze: ustalone linie komórkowe, komórki pierwotne izolowane od pacjentów oraz prawidłowe limfocyty pozyskiwane z ludzkich migdałków. W Zadaniu 2 przetestujemy skuteczność badanej terapii w modelach mysich. Ocenimy, jak badana kombinacja leków wpływa na wzrost nowotworu zlokalizowanego, rozsianego, jak również na tworzenie przerzutów. Zadanie 3 ma na celu wyjaśnienie mechanizmu działania badanej terapii. Odpowiemy na na pytanie, w jaki sposób dochodzi do synergistycznego efektu cytotoksycznego, i zbadamy rolę reaktywnych form tlenu w tym procesie. Ponadto ocenimy wpływ badanej terapii na szlaki sygnałowe aktywowane w nowotworach wywodzących się z limfocytów B i spróbujemy wyjaśnić szczególną wrażliwość tego typu nowotworów na działanie tej terapii.
Sonata bis (2016-2020) – kierownik: dr Małgorzata Firczuk
Badanie skuteczności nowych pro-oksydacyjnych strategii w leczeniu ostrej białaczki limfoblastycznej B komórkowej
Ostra białaczka limfoblastyczna B komórkowa jest nowotworem złośliwym układu krwiotwórczego. Spowodowana jest zwiększoną liczbą niedojrzałych form limfocytów B, tzw. limfoblastów, w szpiku kostnym. Ten rodzaj białaczki najczęściej występuje u dzieci. W leczeniu stosuje się prawie wyłącznie chemioterapeutyki. Większość chorych dobrze odpowiada na leczenie, jednak u około 20% pacjentów dochodzi do nawrotu choroby, często opornej na leczenie. Ze względu na wysoką częstość zachorowań, pomimo coraz skuteczniejszych protokołów leczenia, ten typ białaczki jest, po wypadkach i urazach, wiodącą przyczyną zgonów u dzieci.
Przyczyny nawrotu nie są dokładnie wyjaśnione. Jedną z przyczyn nawrotu może być odpowiedź komórek białaczkowych na stres oksydacyjny. Limfoblasty namnażają się w szybki, niekontrolowany sposób. Wymaga to przyspieszonego metabolizmu. Pod jego wpływem, a także na skutek leczenia chemioterapeutykami, w limfoblastach produkowane są zwiększone ilości reaktywnych form tlenu i dochodzi do stresu oksydacyjnego. To z kolei prowadzi do ekspresji enzymów antyoksydacyjnych, które umożliwiają komórkom nowotworowym przeżycie w warunkach stresu. Co więcej, enzymy te mogą przyczyniać się do oporności na leczenie. Badania wstępne prowadzone w naszym zespole sugerują, że jedna z grup enzymów antyoksydacyjnych, należąca do rodziny tioredoksyn, może być jednym z czynników napędzających namnażanie komórek białaczkowych. W projekcie chcielibyśmy odpowiedzieć na pytanie, czy enzymy te mogą być nowymi celami terapeutycznymi w leczeniu ostrej białaczki limfoblastycznej. Celem projektu jest dokładne zbadanie, jak zablokowanie tych enzymów wpłynie na przeżycie komórek białaczkowych. Chcielibyśmy również ocenić, czy inhibitory enzymów z rodziny tioredoksyn mogą przełamać oporność na chemioterapeutyki stosowane w leczeniu ostrej białaczki.
Aby osiągnąć powyższe cele, planujemy zastosować kilka modeli badawczych: linie komórkowe, materiał kliniczny (szpik, surowicę) pobrany od pacjentów, oraz mysi model ludzkiej białaczki. W ramach projektu powołany zostanie międzydziedzinowy zespół badawczy obejmujący biologów molekularnych, biochemików, lekarzy, genetyka i bioinformatyka. Lepsze poznanie biologii ostrej białaczki oraz mechanizmów odpowiedzialnych za namnażanie i przeżycie limfoblastów, w szczególności roli enzymów antyoksydacyjnych z rodziny tioredoksyn, przyczyni się do poprawy skuteczności istniejących metod leczenia i może wskazać nowe cele w leczeniu tej choroby.
Opus (2019-2021) – kierownik: dr Angelika Muchowicz
Zbadanie roli limfocytów regulatorowych i 2,3-dioksygenazy indoloaminy w progresji i kształtowaniu immunosupresyjnego mikrośrodowiska przewlekłej białaczki limfocytowej
Choroby nowotworowe stanowią jedną z głównych przyczyn zgonów w Polsce i na świecie. Niestety, zachorowalność na nowotwory wciąż rośnie, co jest poważnym problemem społecznym i gospodarczym. Głównymi metodami leczenia nowotworów są obecnie: chemioterapia, radioterapia i chirurgia. Niestety, metody te nie u wszystkich pacjentów są skuteczne, a poza tym wywołują poważne efekty uboczne. Z tego względu, niezwykle pożądane jest poszukiwanie bardziej skutecznych i bezpiecznych metod leczenia nowotworów. W ostatnich latach, dzięki przełomowym odkryciom w dziedzinie immunologii i postępom w technikach modyfikacji genetycznej, immunoterapia nowotworów stała się realną alternatywą dla wielu chorych na nowotwór. W ostatniej dekadzie nowoczesna immunoterapia uznawana jest za największy przełom w leczeniu nowotworów.
Immunoterapia nowotworów ma na celu zmobilizowanie układu odpornościowego pacjenta przeciwko komórkom nowotworowym. Układ odpornościowy chroni nas przed obcymi cząsteczkami - antygenami, nie tylko pochodzącymi z patogenów, ale także z komórek nowotworowych. Kluczowe dla rozwoju odpowiedzi immunologicznej są tzw. komórki prezentujące antygen, które pochłaniają a następnie prezentują obce cząsteczki limfocytom T i pobudzają je do intensywnych podziałów. W ten sposób zaktywowane limfocyty T zdolne są do zabicia komórek nowotworowych. Niestety, nowotwór rozwija liczne mechanizmy umożliwiające mu ucieczkę spod kontroli układu odpornościowego. Przez to dochodzi do zahamowania limfocytów T oraz osłabienia skuteczności immunoterapii. Niniejszy projekt ma na celu zbadanie wybranych mechanizmów blokowania odpowiedzi immunologicznej przez nowotwór, co w dalszej perspektywie może przyczynić się do poprawy skuteczności immunoterapii nowotworów.
Przykładem nowotworu, którego u wielu pacjentów nie udaje się jeszcze skutecznie wyleczyć za pomocą immunoterapii, jest przewlekła białaczka limfocytowa (PBL). Jest to jeden z najczęstszych nowotworów krwi występujących u dorosłych. PBL jest chorobą przewlekłą, jednak u wielu pacjentów dochodzi stopniowo do rozwoju postaci agresywnej, opornej na leczenie. Dla tej grupy chorych często jedyną alternatywą jest immunoterapia. Jednak ze względu na liczne zaburzenia układu odpornościowego obserwowane u chorych na PBL, immunoterapia często nie jest wystarczająco skuteczna. Jednym z opisywanych zaburzeń jest zwiększony odsetek limfocytów T regulatorowych (Treg). Są to komórki o działaniu hamującym funkcje układu odpornościowego. W mysich modelach guzów litych wykazano, że usunięcie limfocytów Treg stymuluje przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną i może doprowadzić do zahamowania wzrostu guza. Rola limfocytów Treg w białaczkach jest słabo poznana. U chorych na PBL obserwuje się zwiększoną liczbę limfocytów Treg we krwi obwodowej. Dotychczas jednak nie zbadano, jaka jest ich funkcja. Co więcej, u chorych na PBL odnotowano podwyższoną aktywność enzymu metabolizującego tryptofan - 2,3-dioksygenazy indoloaminy (IDO), jednego z kluczowych aktywatorów limfocytów Treg. Obecna wiedza na temat roli limfocytów Treg, mechanizmów ich indukcji i migracji nie jest jednak wystarczająca, aby zastosować ją do poprawy skuteczności terapii.
W niniejszym projekcie zbadamy rolę Treg i IDO w PBL, używając mysiego modelu tej choroby, który bardzo dobrze odzwierciedla dysfunkcje układu odpornościowego obserwowane u chorych na PBL. Chcemy odpowiedzieć na następujące pytania: (1) czy limfocyty Treg wpływają na progresję białaczki?, (2) w jaki sposób eliminacja limfocytów Treg wpływa na liczbę i funkcję efektorowych limfocytów T i komórek prezentujących antygen?, (3) jaka jest rola IDO w akumulacji limfocytów Treg w czasie progresji białaczki?, (4) czy IDO wpływa na progresję białaczki? (5) czy i jak zahamowanie IDO wpływa na funkcje innych komórek układu odpornościowego?
Mamy nadzieję, że wyniki projektu znacznie poprawią wiedzę na temat mechanizmów immunoregulacyjnych wpływających na odpowiedź immunologiczną w PBL. Uważamy, że lepsze zrozumienie mechanizmów immunosupresji w PBL przyczyni się do udoskonalenia terapii tej choroby
Preludium (2019-2022) – kierownik mgr inż. Klaudyna Fidyt
Zbadanie mechanizmów oporności na wenetoklaks i sposobów jej zwalczenia w ostrej białaczce limfoblastycznej B komórkowej z rearanżacjami genu MLL